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Development of Transmission Ambient Pressure Laser Desorption IonizationPostphotoi-onization Mass Spectrometry Imaging
Keke Qi, Yongmei Lv, Ying Xiong, Changlin Tian,* Chengyuan Liu,* and Yang Pan*
发布期刊：Analytical Chemistry
影响因子：6.7
DOI：10.1021/acs.analchem.3c05605
研究背景
质谱成像（MSI）能够免标记实现原位可视化生物组织中的代谢物、脂质和蛋白质空间分布被广泛应用于空间代谢组学研究。常用的离子化技术主要有电喷雾解吸电离和激光解吸电离两种，其中激光解吸电离离子化技术具有更高分辨率的潜力，但使用基质辅助解吸时存在离子化效率低和离子抑制的问题，导致其检测小分子代谢物时灵敏度受限，为实现空间分辨率和检测灵敏度的双重提升。本研究整合透射激光的高分辨潜力和光后电离的高效离子化能力，结合鼓泡系统引入气相掺杂剂，开发了透射式常压激光解吸/光后电离（t-AP-LDI/PI）技术。在无基质条件下实现对中性分子的高效电离，最终在实现4μm高空间分辨率的同时，将多种代谢物与脂质的检测灵敏度提高1–3个数量级，成功实现了小鼠海马组织4μm高分辨成像，并在小脑和黑色素瘤组织微区可视化中验证了其应用潜力，为生物组织高空间分辨率质谱成像提供了有效解决方案。
技术方法
空间代谢组学、透射式大气压激光解吸电离/光后电离质谱成像（t-AP-LDI/PI-MSI）技术、串联质谱（MS/MS）
研究亮点
1、研究开发的t-AP-LDI/PI技术成功融合了激光的高分辨优势和光后电离的高灵敏度优势，实现无基质条件下高灵敏高分辨成像，空间分辨率突破4μm。
2、鼓泡系统的引入：本研究创新性地引入鼓泡系统以实现掺杂气体的稳定注入，从而提升检测灵敏度和实验可重复性。
研究思路
研究首先成功搭建了透射式常压激光解吸/光后电离质谱成像系统（t-AP-LDI/PI-MSI），随后，以小鼠脑匀浆为模型对系统进行优化，调控激光泵浦电流、频率、扫描速度、样品与传输管距离及掺杂剂流量等关键参数。制备脑组织、海马组织与黑色素瘤组织冷冻切片，并进行成像扫描，成功揭示了小脑微区代谢物的特异性分布、海马微区结构，以及黑色素瘤的代谢异质性和侵袭趋势。
研究结果
1、小鼠脑匀浆化合物种类检出数量增加
在t-AP-LDI/PI技术实验过程中，泵电流、激光频率和样本组织载玻片与传输管入口之间的距离是影响解析过程和检测灵敏度的关键参数，多次实验结果证明，将参数设置为泵电流1.8 A，激光频率1000 Hz，样品与传输管入口距离约 1 mm 是最佳实验条件（图2A）。在最佳实验条件下，研究用小鼠脑匀浆作为样品，将t-AP-LDI/PI、t-AP-LDI、DESI/PI和MALDI的成像灵敏度进行对比。结果显示，单一的t-AP-LDI技术电离效率很低，开启光后电离后，检测到的物种数量和信号丰度显著增加（图2E），而进一步引入气态掺杂剂甲苯后，通过质子转移与电荷交换反应，成功从小鼠脑组织中检测到超过100种内源性代谢物和脂质，其信号丰度提升了2-3个数量级（图2B-D）。对比其他技术（MALDI、AP-MALDI、DESI/PI），t-AP-LDI/PI能够检测到最多种类的化合物（图2F）。
图1 t-AP-LDI/PI MSI 方法的参数优化与性能评估
2、小鼠脑10μm成像
研究人员采用 t-AP-LDI/PI-MSI对相邻小鼠小脑切片在正、负离子模式下进行成像，横向分辨率达10 μm。结果如图2所示，不同分子在小脑微区呈现特异性分布。正离子模式下，组胺主要位于颗粒层（GL），与腺嘌呤和鸟嘌呤的分布一致；二酰基甘油DG富集于分子层（ML）；维生素D3与胆固醇则集中在白质（WM），与类固醇代谢功能相符。叠加成像显示，DG、组胺与胆固醇在ML、GL和WM间互补分布。负离子模式下，检测到丰富的小分子代谢物、脂肪酸（如油酸）、磷脂类（PE、PA）等。天冬氨酸（m/z 132.03）主要分布于GL，而N-乙酰天冬氨酸在GL与ML均呈高丰度，作为神经元标志物，其水平变化与多种神经疾病密切相关。总体而言，t-AP-LDI/PI 实现了对小脑组织中神经递质、核苷酸、脂类等关键分子的高覆盖高分辨成像，展示了其在脑组织代谢研究中的应用潜力。
3、小鼠海马组织4 μm成像
在建立t-AP-LDI/PI-MSI方法后，研究团队通过系统优化激光参数实现了空间分辨率的显著提升。研究发现空间分辨率受激光泵浦电流、频率及步进电机移动速度的共同影响：降低泵浦电流、提高激光频率或加快移动速度均可减小激光烧蚀线宽，从而提升分辨率。在此基础上，团队成功对小鼠海马组织实现了4μm高分辨成像，清晰揭示了腺嘌呤、胆固醇、DG(32:0)和PE(40:6)等分子在海马角1区（CA1）、齿状回（DG）、胼胝体（CC）、上丘臂（BSC）等海马微区的特异性分布，其中胆固醇以点状形态富集于胼胝体区域，而腺嘌呤则在CA1和齿状回区域呈现高丰度分布，与神经元胞体定位特征相符。
图3 t-AP-LDI/PI MSI 在小鼠海马组织中的高分辨率成像
4、黑色素瘤10μm成像
研究人员进一步将 t-AP-LDI/PI MSI 应用于黑色素瘤皮肤组织切片。经病理学鉴定，该组织自上而下可分为角质层、颗粒层、肿瘤区及正常组织四个微区。在 10 μm空间分辨率下，清晰显示不同代谢物的空间分布，如 N-乙基乙酰胺和 GABA 富集于角质层，腺苷和 DG(36:1) 富集于颗粒层，而DG(34:2) 主要分布于肿瘤区。负离子模式下，天冬氨酸、肌氨酸和丝氨酸等氨基酸集中于角质层，验证其在皮肤水分平衡中保湿因子的作用。更重要的是，胆固醇和维生素 D3 在肿瘤细胞密集区显著富集，反映出异常的胆固醇代谢与高度异质的肿瘤微环境；同时，棕榈酸、亚油酸和油酸等多种脂肪酸在黑色素瘤区域高表达，形成富含脂肪酸的微环境，可能削弱免疫细胞功能。进一步分析揭示，脂肪酸与甘油磷脂代谢通路被显著重编程，磷脂酰肌醇物种积累并激活 PI3K/AKT 信号通路，促进黑色素瘤细胞侵袭性表型。综上，t-AP-LDI/PI MSI 不仅揭示了黑色素瘤组织的代谢重编程，还为理解其发生发展及早期诊断提供了关键分子线索。
图4 .黑色素瘤中部分代表性化合物在t-AP-LDI/PI正负离子模式下的质谱成像数据
研究结论
本研究开发了一种兼顾高分辨与高灵敏度的透射式激光解吸/光后电离质谱成像技术（t-AP-LDI/PI-MSI），该技术核心在于将激光解吸与光后电离相结合，并创新引入鼓泡系统注入掺杂剂大幅提升电离效率。实验结果表明，其信号强度较传统方法提升2-3个数量级，并成功在小鼠小脑和黑色素瘤组织中实现10 μm分辨率成像，在小鼠海马组织更达到4 μm的高空间分辨率。该技术集高灵敏度、高分辨率、无需基质、操作便捷等优势于一体，兼容性强，应用前景广阔。
文章链接：https://doi.org/10.1021/acs.analchem.3c05605
